Сокращенный  материал, опубликованный в  журнале СМЭ, 2000, №1, с.27-32

Определение в моче 9-карбокси-11-нор-D ⁹-тетрагидроканнабинола

(Катаев С.С., Смирнова И.Ю.)

Рост злоупотреблений продуктами конопли (гашиш, марихуана), на фоне общего всплеска наркомании, обусловлен в первую очередь низкой стоимостью и доступностью используемого сырья. Это в свою очередь ведет к необходимости проведения химического исследования на наличие в организме человека основных действующих веществ конопли каннабиноидов - D⁹-тетрагидроканнабинола (ТГК), каннабинола (КНБ), каннабидиола (КНД), а также их метаболитов.

Основные пути метаболизма ТГК ведут к образованию полярных гидроксильных производных, основным из которых является 9-карбокси-11-нор-D⁹-тетрагидроканнабинол (ТГК-кислота), причем большая часть метаболитов (60-80%) выводится с мочой и калом в форме конъюгатов [1]. Однако, сам ТГК с мочой выводится лишь в следовых количествах [2], в то время как концентрация ТГК-кислоты в моче со временем растет и зависит от дозы ТГК. Так, пик концентрации ТГК-кислоты наблюдается через 7,7± 0,8 (89,8± 31,9 нг/мл) и 13,9± 3,5 (153,4± 49,2 нг/мл) часов после разового курения дозы, приблизительно 15,8 мг и 33,8 мг ТГК, и обнаруживается до 33,7± 9,2 и 88,6± 9,5 часов соответственно [3]. Таким образом, наличие ТГК-кислоты является важным показателем для установления факта употребления продуктов конопли.

Следует отметить, что для уменьшения естественных потерь ТГК-кислоты в образцах мочи, отбираемых для исследования на каннабиноиды, их следует хранить в замороженном виде. Результаты зависимости сохранности ТГК-кислоты в моче от условий хранения, по литературным данным [4], сведены в таблицу 1.

Таблица 1. Сохранение ТГК-кислоты в моче в зависимости от условий хранения.
 

Время хранения	Условия хранения	Снижение концентрации в %
10 дней	при комнатной температуре	более 22,4
4 недели	в холодильнике	8,1
40 дней	замороженные	8,0± 1,6
1 год	замороженные	15,8± 4,2
3 года	замороженные	19,6± 6,7

 

Невысокие концентрации аналитических веществ требуют использования в судебно-химическом исследовании селективных и высокочувствительных методов анализа, таких как иммуноферментный анализ и хроматомасс-спекрометрия (ГХ/МС). Далее представлена общая схема исследования с использованием ГХ/МС.

Наличие фенольных и карбоксильной гидроксигрупп в структуре каннабиноидов и ТГК-кислоты требует снижения полярности для улучшения хроматографических характеристик последних. Ниже приведена схема дериватизации, основанная на получении метиловых эфиров названных соединений.

Для КНБ и КНД реакция протекает аналогично ТГК, с той лишь разницей, что КНД образует диметильное производное. Полученные метильные производные устойчивы и сохраняются длительное время (до 1-2 недель).

Оборудование.

Газовый хроматограф НР5890А серии II с масс-селективным детектором НР5972А. Капиллярная кварцевая колонка НР-5MS 25 м Х 0,21 мм Х 0,33 мкм. Скорость потока газа носителя - гелия 1,5 мл/мин, без деления потока. Температура инжектора 250^оС. Температура колонки программируемая: 2 минуты при 70^оС с дальнейшим повышением до 270^оС со скоростью 20^оС/мин, общее время анализа 20 минут. Температура интерфейса МСД 280^оС. Ионизация электронным ударом с энергией электронов 70 эВ. Режим работы МСД - полное сканирование ионов от 45 до 450 атомных масс.

Методы.

Щелочной гидролиз. К 10 мл мочи прибавляют 0,5 мл 50 % раствора гидроксида натрия, выдерживают при 60^оС в течение 20 минут.

К пробе мочи после гидролиза, добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 2 (около 1 мл). Экстракцию проводят дважды по 10 мл смеси гексан-этилацетат (7:1). Органическую фазу отделяют, экстракты объединяют и упаривают досуха.

К сухому остатку прибавляют 100 мкл безводного ацетона, 2-5 мг карбоната калия и 100 мкл метилиодида. Пробу плотно укупоривают и нагревают при 60^оС в течение 40 минут. После охлаждения, флакон вскрывают, растворитель упаривают. Сухой остаток двукратно экстрагируют по 2 мл гексана. Гексановые извлечения объединяют, выпаривают досуха. Пробу реконструируют 100 мкл этанола и 1 мкл исследуют методом ГХ/МС.

В таблице 2 приведены основные хроматографические и масс-спектральные данные метильных производных ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты.

Таблица 2. Хроматографические и масс-спектральные данные для метилированных ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты.
 

Соединение	М.м.	Характеристические ионы, m/z*						tуд. абс.,мин	RI**
ТГК-Ме	328	313	328	285	314	257	329	12,07	2423
КНБ-Ме	324	309	310	324	238	252	209	12,36	2490
КНД-2Ме	342	287	342	223	213	288	261	12,51	2522
ТГК-к-та 2Ме	372	313	357	372	314	358	341	13,99	2779

^* Ионы расположены в порядке убывания интенсивности.

^** Индексы удерживания определяли по н-алканам.

Реактивы  и  материалы.
1. Натриевая  щелочь, х.ч.
2. Хлороводородная  кислота   концентрированная, х.ч.
3. Калия  карбонат, х.ч, высушенный  при  170 ^оС.
4. Гексан, х.ч.
5. Этилацетат, х.ч.
6. Ацетон, х.ч. Очистка [5]: К  смеси ацетон  и  безводный  карбонат  калия  (20:1 об/вес) осторожно  частями  прибавляют  не  большое  количество  перманганата  калия  и  кипятят  с  обратным  холодильником  до  исчезновения  фиолетовой  окраски. Далее  растворитель  перегоняют.  Т кипения  56,2 ^оС. Хранят над б/в К₂СО₃.
7. Иодметан (метилиодид), х.ч. Очистка [5]: Растворитель  встряхивают  с  разбавленным  тиосульфатом  натрия  до  обесцвечивания, затем  моют  водой, разбавленным  карбонатом  на-трия  и  снова  большим  количеством  воды.  Растворитель  сушат  безводным  гранулированным хлоридом  кальция   и  перегоняют.  Т кипения 42,8^оС. Реагент  хранят  в  холодильнике  в  посуде  из  темного  стекла,  в  контакте  с  безводным  хлоридом  кальция  и  небольшим  количеством  металлической  ртути (ртуть лучше  заменить  медной  стружкой или проволокой).
8. Посуда, используемая  в  процессах  гидролиза и дериватизации силанизированная.  Силанизация стеклянной  посуды: посуда моется  хромовой  смесью, сушится. Ополаскивается метанолом, высушивается, затем  обрабатывается 1% раствором  триметилхлорсилана  в  безводном  толуоле. Выдерживается  в  течение  20 минут,  ополаскивается метанолом и сушится.

Приложение. На рисунке 1-4 представлены масс-спектры метильных производных ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты соответственно. На рисунке 5 приведены фрагменты хроматограммы мочи лица употреблявшего отвар конопли в молоке с экстракцией по 100% ионам в спектрах метильных производных ТГК, КНБ, КНД, ТГК-кислоты. На рисунке 6, 7 приведены фрагменты хроматограммы мочи лица, курившего марихуану.

Примечание: использование щелочного гидролиза приводит к полной потере КНД, однако позволяет более полно извлекать ТГК-кислоту.

Приложение.

 

Рис.1. Масс-спектр метилового эфира D⁹-тетрагидроканнабинола.

Рис.2. Масс-спектр метилового эфира каннабинола.

Рис.3. Масс-спектр диметилового эфира каннабидиола.

Рис.4. Масс-спектр диметилового эфира 9-карбокси-11-нор-D⁹-тетрагидроканнабинола.

Рис.5. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи с экстракцией по наиболее интенсивным ионам метильных производных: КНБ (m/z 309) 12,38 мин, КНД (m/z 287) - отсутствует, ТГК-кислоты (m/z 313) - 14,01 мин.

Рис.6. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по наиболее интенсивным ионам в спектрах метильных производных: КНБ (m/z 309) - отсутствует, КНД (m/z 287) - отсутствует, ТГК-кислоты (m/z 313) - 13,96 мин.

Рис.7. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по характеристическим ионам метилированной ТГК-кислоты (m/z 313, 357, 372).

 

 

Литература:

1. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. - М.: "Мысль", 1993.
2. Baselt R.C., Cravey R.H. Disposition of Toxic Drug and Chemicals in Man.- 4-d Ed.- Chemical Toxicology Institute Forest City.- California. - 1995.
3. Huestis M.A., Mitchell J.M., Cone E.J. // J. Anal. Toxicol. - 1996.- Vol.20, №6.- P.441-452.
4. Fraga S.G., Estevez J.F., Romero C.D. // Ann. Clin. Lab. Sci.- 1998.- Vol.28, №3.- P.160-162.
5. Blau K., King G.S., Handbook of  Derivatives  for  Ghromatography.- London, Philadelphia, PA. Rheine- 1978. - 576 p.

Комментарий:  обратите внимание на используемые для дериватизации реактивы: ацетон и метилиодид, если они приобретены градации х.ч. можно не перегонять, но ацетон обязательно сушить над безводным карбонатом калия. И ацетон, и карбонат калия следует обновлять (менять осушитель и сушить, соответственно) не реже раза в месяц. О дериватизации:  ацетона можно брать больше 0,2-0,5 мл, а метилиодида  меньше  30-50 мкл, при этом  после охлаждения, ацетоновый раствор можно декантировать в чистую посуду и реконструировать не этанолом, а этилацетатом (это не так больно ударяет по колонке).  По ХМС анализу:  исследование оптимально вести в режиме селективного ионного мониторинга, т.к. метода  целевая на ТГК кислоту. Но в любом случае будь то режим селективного ионного мониторинга или полного ионного сканирования в заданном диапазоне (оптимум 200-400 а.е.) к напряжению настройки МС детектора следует добавлять 300-400 В. По ходу пробоподготовки стадии фильтрации отсутствуют, при образовании эмульсии ее разрушают центрифугированием, отбирать экстракты аккуратно (без водной фракции), флакон перед помещением в него экстракта следует ополоснуть этанолом. Стеклянная посуда для анализа как минимум мытая хромовой смесью, оптимально силанизированная.

Катаев Сергей 

 mailto: forenschemist@narod.ru

На первую страницу