Актуальные аспекты судебной медицины.-Выпуск VII.
Сборник научных работ.- Ижевск: Экспертиза, 2001, с. 62-66.
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ТЕСТ МОЧИ, КАК ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ ГРУППЫ ОПИЯ
Катаев С.С., Гаранин В.П., Смирнова И.Ю.
(Пермское областное бюро СМЭ - нач. Перминов В.И.)
Анализ мочи от живых лиц на алкалоиды группы опия, либо на наркотические вещества становится все более частым предметом судебно-химического исследования. При этом в качестве предварительного испытания требуется простой, чувствительный, специфичный и быстрый метод, позволяющий решить вопрос наличия, либо отсутствия определенной группы веществ и направленности дальнейшего исследования образца. Нами проведена сравнительная оценка использования методов иммунохроматографического анализа (ИХА) и тонкослойной хроматографии (ТСХ), как предварительного метода анализа мочи на наличие алкалоидов группы опия. В качестве подтверждающего метода использовали хроматомасс-спектрометрию (ГХ/МС).
Метод ИХА является одностадийным иммунотестом и основан на конкурентном связывании исследуемого вещества на мембране иммунохроматографического абсорбционного устройства.
Исследование проводилось в сравнении с традиционным анализом на алкалоиды группы опия - методом ТСХ после кислотного гидролиза мочи и жидкость-жидкостной экстракции.
Материалы и оборудование.
Реактивы и растворители градации хч. Реактивы Марки и Фреде свежеприготовленные. В качестве метчиков для ТСХ использовали 1% спиртовые растворы морфина гидрохлорида (ФС 413 ГФ X) и кодеина основания (ФС 170 ГФ X). Пластинки для ТСХ - "Сорбфил-ПТСХ-В-УФ" (ЗАО "Сорбполимер", Россия). Иммунотесты для качественного экспресс-определения опиатов в моче DRuG Screen OPIATES Test (DRG International Ink, США) - регистрационное удостоверение МЗРФ № 98/1415 от 27.10.98 на диагностический набор реагентов для экспресс - диагностики содержания наркотических веществ в моче. Термоблок ПЭ-4030 (ОАО “Экрос”, Россия). Газовый хроматоргаф НР5890 серии II с масс-селективным детектором НР5972А (Hewlett-Packard, США).
Процедуры и методы.
ИХА исследование. Исследование проводили в соответствии с прилагаемой инструкцией. Во флакон помещали 2 мл мочи, контролировали рН по универсальной индикаторной бумаге, доводили температуру до комнатной. В мочу помещали тестовую пластинку, через 30 секунд пластинку вынимали и помещали на ровную горизонтальную поверхность. Результат определяли в интервале 5-10 минут. При наличии одной окрашенной полосы в контрольной зоне фиксировали положительный результат. При наличии двух полос в контрольной и тестовой зонах фиксировали отрицательный результат.
Извлечение. К 10 мл мочи прибавляли 2 мл концентрированной соляной кислоты, флакон плотно закрывали и выдерживали 20 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения гидролизат фильтровали через бумажный фильтр. К фильтрату прибавляли 25% водный раствор аммиака до рН9-10 и дважды экстрагировали смесью хлороформ-н-бутанол (9:1) порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтрат упаривали до объема 8-9 мл, доводили до 10 мл хлороформом и разделяли на две аликвоты, соответствующие 8 и 2 мл мочи. Аликвоты экстракта упаривали досуха в токе теплого воздуха (60оС).
ТСХ исследование. Сухой остаток аликвоты извлечения из 8 мл мочи растворяли в 100 мкл этанола и наносили поровну в стартовые зоны 1 двух хроматографических пластин, в зоны 2 наносили спиртовые растворы метчиков морфина и кодеина. После высыхания пятен, пластинки элюировали в системе растворителей этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1). Предварительное насыщение камеры 30 минут. Длина пробега элюента 8 см. Хроматограммы высушивали. Первую пластинку проявляли реактивом Марки (капельно). Вторую - реактивом Фреде (капельно). При наличии окрашенных зон на уровне пятен метчиков морфина (красно-фиолетовое пятно с hRf 24± 2) и/или кодеина (синее пятно с hRf 33± 3) фиксировали положительный результат.
ГХ/МС исследование. Сухой остаток аликвоты извлечения из 2 мл мочи растворяли в 1 мл хлороформа и реэкстрагировали 1 мл 0.1 н раствора соляной кислоты в течении 5 минут. Хлороформный слой отбирали и отбрасывали. К водной фазе прибавляли 0,5 г сульфата аммония и 25% водный раствор аммиака до рН 9-10, затем экстрагировали 2 мл смеси хлороформ-н-бутанол (9:1). Органическую фазу отбирали, переносили во флакон и упаривали досуха. К сухому остатку прибавляли 100 мкл безводного пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида. Флакон герметично укупоривали и нагревали в термоблоке 20 минут при 60оС. После охлождения, флакон вскрывали и упаривали растворитель досуха. Сухой остаток растворяли в 100-200 мкл метиленхлорида и 1 мкл вводили в инжектор хроматографа. Температура инжектора 250оС. Капиллярная кварцевая колонка НР-5MS 25 м Х 0,25 мм. Скорость потока газа носителя - гелия 1,5 мл/мин, без деления потока. Температура колонки программируемая: 2 минуты при 70оС с дальнейшим повышением до 270оС со скоростью 20оС/мин, общее время анализа 20 минут. Температура интерфейса МСД 280оС. Ионизация электронным ударом с энергией электронов 70 эВ. Режим работы МСД - полное сканирование ионов от 45 до 450 атомных масс. Положительный результат фиксировали при наличии в хроматограмме ацетилированных производных морфина и/или кодеина. Время удерживания ацетилкодеина 12,74 минуты (RI 2610), диацетилморфина 13,46 минуты (RI 2738). Чувствительность для морфина и кодеина не хуже 50 нг/мл мочи, для каждого.
Обсуждение результатов.
Общее число исследованных образцов мочи составило 73 пробы. Результаты
исследования представлены в таблице:
|
Количество образцов |
Результат теста ИХА |
Результат ТСХ |
Результаты ГХ/МС |
% от общего количества |
|
|
Р-в Марки |
Р-в Фреде |
||||
|
30 |
+ |
+ |
+ |
+ |
41,10 |
|
1 |
+ |
- |
+ |
+ |
1,37 |
|
3 |
+ |
- |
- |
+ |
4,11 |
|
1 |
+ |
- |
- |
- |
1,37 |
|
38 |
- |
- |
- |
- |
54,05 |
"+" - положительный результат;
"-" - отрицательный результат.
Как видно из таблицы, методом ИХА получено 34 из 34 положительных (чувствительность -100%) и 38 из 39 отрицательных (специфичность - 97,4%), при одном ложноположительном результате. Методом ТСХ, при исследовании тех же 73 проб мочи, определено 31 из 34 положительных (чувствительность - 91,2%) и 39 из 39 отрицательных (специфичность - 100%), при 3 ложноотрицательных результатах. Исследованием всех образцов методом ГХ/МС определено 34 положительных и 39 отрицательных результата.
В качестве проявителей в методе ТСХ использовали реактивы Марки и Фреде, хотя применение реактива Драгендорфа дает значительное увеличение чувствительности, в то же время, ввиду его низкой специфичности резко растет и количество ложноположительных результатов. При проявлении реактивом Марки чувствительность составила 500 нг/мл для морфина и кодеина. При проявлении реактивом Фреде - порядка 300-400 нг/мл для морфина и 400-500 нг/мл для кодеина. При этом чувствительность данного метода может варьировать, как по объективным, так и субъективным факторам, например: наличие и количества балластных и/или других веществ, качество процедур экстракции, нанесения проб, подогревание пластинки перед проявлением и др.
Заявленная пороговая чувствительность тестов ИХА для морфина - 300 нг/мл мочи, что соответствует рекомендациям Администрации по наркологии и психическому здоровью (SAMHSA, США). При этом так же детектируются производные и родственные морфину соединения: морфина глюкоуронид (300 нг/мл), героин (300 нг/мл), дионин (350 нг/мл), кодеин (300 нг/мл), налорфин (500 нг/мл), налоксон (400 нг/мл), тебаин (600 нг/мл). Таким образом, тесты ИХА обладая фиксированной высокой чувствительностью, имеют низкую селективность в групповом отношении, что требует для проведения подтверждающего исследования высокочувствительного и более селективного метода анализа (ВЭЖХ, ГХ, ГХ/МС).
Исследование образца мочи, давшего ложноположительный результат при анализе методом ИХА, не выявил наличия каннабиноидов, веществ кислого, нейтрального и основного характера выделяемых методом жидкость-жидкостной экстракции. В образцах с отрицательными результатами методом ГХ/МС были обнаружены: никотин и котинин (в 27 образцах), кофеин (14), этанол 1,4-2,1 г/л (3), эфедрин (2), димедрол (1), продукты метаболизма анальгина (2), лидокаин (1), но-шпа (1), фенобарбитал (1), преднизолон (1), каннабидиол и тетрагидроканнабиноловая кислота (1). То есть тест ИХА показал индифферентность к найденным соединениям.
Исходя из системы учета выполняемой экспертом работы в полных анализах (ПА) на схеме представлены расчеты для отрицательных и положительных предварительных исследований выполненных методами ИХА и ТСХ (по реактиву Фреде):
|
ИХА |
|
ТСХ |
||
|
38 "-" |
35 "+" |
42 "-" |
31 "+" |
|
|
0,05 ПА |
0,05 ПА |
гидролиз 0,3 ПА ТСХ "-" 0,05 ПА |
гидролиз 0,3 ПА ТСХ "+" 0,15 ПА |
|
|
S = (38+35) x 0,05 = 3,65 ПА |
S = 42 Х 0,35 +31 x 0,45 = 28,65 ПА |
|||
Как видно из схемы, трудозатраты при исследовании методом ТСХ составляют 28,65 ПА, методом ИХА - 3,65 ПА (т.е. почти в 8 раз меньше). Это указывает на определенное преимущество метода ИХА.
Заключение.
Таким образом, метод ИХА, уступая методу ТСХ в селективности, значительно выигрывает по чувствительности, унификации и простоте выполнения исследования, а так же имеет ряд несомненных достоинств:
Несмотря на то, что исследование проведено на ограниченном количестве экспертного материала, уже эти результаты показали возможность применения метода ИХА в рутинной работе по анализу наркотических средств в моче живых лиц, в целях выявления алкалоидов группы опия. Экспресс-тесты ИХА имеют судебно-отрицательное значение, позволяют отсеивать отрицательные пробы мочи и ограничить круг объектов для дальнейшего инструментального анализа (подтверждающего исследования) только пробами с положительными результатами.
Важно отметить, что при использовании метода ИХА только на основании результатов подтверждающего исследования можно сделать заключение о наличии соединений группы опия.
