Сравнение предварительных методов исследования мочи для обнаружения каннабиноидов
Приведенные данные является выдержкой из статьи журнала СМЭ, 2005, №2, с.35-38.
Сокращения
ФПИА - флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ;
ТГК-кислота - 11-нор-дельта-9-тетрагидроканнабинол-9-карбоновая кислота;
ТГКВ-кислота - 11-нор-дельта-9-тетрагидроканнабиварин-9-карбоновая кислота;
ТСХ - хроматография в тонком слое сорбента;
ИХА - иммунохроматографический анализ.
Материалы.
11-нор-дельта-8-тетрагидроканнабинол-9-карбоновая кислота (ICN, США), 25% раствор тетраметиламмония гидроксида в метаноле (ICN, США). Калибраторы, контроли и реагенты "Cannabinoids U" для флуоресцентно-поляризационного анализатора TDxFLx ("Abbott", США). Пластины для ВЭТСХ “Сорбфил”-ПТСХ-В или “Сорбфил”-ПТСХ-В-УФ (ЗАО "Сорбполимер", Россия). Тесты ИХА для качественного экспресс-определения каннабиноидов в моче на основе конкурентного одностадийного иммуноанализа на мембранах DRuG Screen THC Test ("DRG International Inc.", США). Прочный синий ББ ("LACHEMA", Чехословакия). Все используемые растворители градации х. ч.
Методики исследования
ИХА-исследование проводили в соответствии с прилагаемой к экспресс-тестам инструкцией. Во флакон помещали 2 мл мочи, доводили температуру до комнатной, контролировали рН по универсальной индикаторной бумаге (интервал рН 4,5-8). В мочу помещали тестовую пластинку, через 30 с ее вынимали и помещали на ровную горизонтальную поверхность. Результат определяли в интервале 5-10 мин. При наличии одной окрашенной полосы в контрольной зоне фиксировали положительный результат. При наличии двух полос в контрольной и тестовой зонах независимо от яркости окраски фиксировали отрицательный результат. Порог чувствительности составил 100 нг ТГК-кислоты на 1 мл мочи.
ФПИА-исследование. В картридж помещали 0,2 мл образца мочи и исследовали на флуоресцентно-поляризационном анализаторе TDx/FLx ("Abbott"), с каждой серией образцов проводили исследование нижнего и верхнего контролей. Предел значимости результата - 25 нг/мл.
ТСХ-исследование. См. ссылку.
ХМС-исследование. См. ссылку.
Расчет относительной чувствительности, специфичности и точности для методов проводили по формулам:
чувствительность = [истинно "+"/(истинно "+" + ложно "-")] . 100;
специфичность = [истинно "-"/(истинно "-" + ложно "+")] . 100;
точность = [истинно "+" + истинно "-"/(истинно "+" + истинно "-" + ложно "+" + ложно "-")] . 100.
Результаты исследования и их
обсуждение
В исследовании использовали реальные образцы мочи лиц, подозреваемых в употреблении наркотических веществ (в том числе продуктов конопли). Общее количество проб составило 160. Сравнение трех методов предварительного исследования мочи показало, что все три метода ФПИА, ИХА и ТСХ имеют высокую специфичность, достаточно высокую чувствительность и позволяют проводить предварительный анализ мочи на наличие каннабиноидов. В табл. 1 приведены результаты качественного исследования тремя методами для 160 образцов мочи.
Таблица 1. Результаты исследования образцов мочи на наличие каннабиноидов.
|
Показатель исследования |
ИХА |
ФПИА |
ТСХ |
|
Количество положительных результатов |
72 |
83 |
78 |
|
Количество ложноотрицательных результатов |
11 |
0 |
5 |
|
Количество ложноположительных результатов |
0 |
0 |
0 |
|
Количество отрицательных результатов |
77 |
77 |
77 |
|
Чувствительность (%) |
86,7 |
100 |
94,0 |
|
Специфичность (%) |
100 |
100 |
100 |
|
Точность (%) |
93,1 |
100 |
96,9 |
Метод ФПИА не показал ни одной ложноотрицательной пробы. Исследование количественных характеристик 11 проб, давших ложноотрицательные результаты методом ИХА, показало, что методом ФПИА в образцах определяются концентрации каннабиноидов в интервале 29,6-78,3 нг/мл (среднее 48,4± 16,9 нг/мл). Методом ХМС найдены ТГК-кислота в интервале концентраций 4,9-37,7 нг/мл (среднее 15,7± 9,1 нг/мл) и суммы ТГК и ТГКВ кислот - 5,9-43,3 нг/мл (среднее 22,2± 12,3 нг/мл).
Несмотря на невысокое содержание в исходном сырье дельта-9-тетрагидроканнабиварина, являясь менее липофильным, его метаболит ТГКВ-кислота определяется в более короткие сроки, чем ТГК-кислота. Являясь С3-гомологом ТГК-кислоты, обладая аналогичной структурой и близкими физико-химическими свойствами, ТГКВ-кислота вносит свой вклад в результаты иммунных методов ФПИА и ИХА, а также метода ТСХ, локализуясь в одном пятне с ТГК-кислотой. Определение в моче ТГКВ-кислоты методом ХМС может служить одним из маркеров недавнего употребления продуктов конопли.
Характер количественных характеристик для метода ТСХ в отношении полуколичественного исследования методом ФПИА и результатов ХМС приведены в таблице 2.
Таблица 2. Количественные характеристики методов ТСХ и ФПИА.
|
ТСХ: окраска пятна ТГК- кислоты |
Нет окрашивания |
Бледное красно-фиолетовое |
Красно-фиолетовое |
Красно-фиолетовое |
|
ФПИА: Интервал концентраций, нг/мл Среднее значение, нг/мл |
29,6-75,8 49,9± 19,1 |
32,4-119,0 67,9± 29,1 |
51,2-134,9 100,9± 23,7 |
Более 135 |
|
ГХ/МС: ТГК- кислота Интервал концентраций, нг/мл Среднее значение, нг/мл |
4,9-37,7 16,1± 13,3 |
9,7-73,7 32,1± 22,7 |
21,1-114,8 55,0± 23,9 |
63,3-1403,1 289,8± 285,6 |
|
ГХ/МС: сумма ТГК- и ТГКВ- кислот Интервал концентраций, нг/мл Среднее значение, нг/мл |
5,9-43,3 26,0± 16,3 |
10,3-97,3 46,0± 32,6 |
22,9-147,8 84,5± 34,0 |
116,0-3417,5 519,5± 693,0 |
|
Всего образцов: |
5 |
11 |
20 |
47 |
Как видно из приведенных данных, количественные характеристики проб с отрицательными результатами для методов ТСХ и ИХА близки. В то же время, метод ТСХ, имея более высокую чувствительность, дает меньшее количество ложноотрицательных результатов. В отличие от методов ИХА и ФПИА, чувствительность метода ТСХ определяется суммой ТГКВ- и ТГК-кислот, тогда как на результаты иммуноферментных методов оказывают влияние как нативные соединения, так и сумма их метаболитов, что непосредственно отражается на их чувствительности, либо пороге значимости. Таким образом, несмотря на более высокую чувствительность метода ТСХ (20 нг/мл) по сравнению с ФПИА, он дает некоторое количество ложноотрицательных результатов. Это обусловлено тем, что метод ТСХ является селективным по отношению к ТГКВ- и ТГК-кислотам.
Несмотря на тот факт, что ФПИА объективно не дал ни одного ложноотрицательного и ложноположительного результата, в 6 образцах концентрации ТГК-кислоты находились по результатам ХМС исследования ниже рекомендуемой SAMHSA (ранее NIDA, США) значимой пороговой концентрации 15 нг/мл и определялась в интервале значений 4,9-14,5 нг/мл. При использовании метода ТСХ только 3 положительных образца имели концентрацию в интервале 9,7-14,5 нг/мл. Для тестов ИХА такие пробы отсутствовали.
К положительным моментам метода ИХА можно отнести: высокую специфичность и скорость исследования (5-10 минут); отсутствие длительной пробоподготовки объекта и наличия специальных навыков персонала; не требует серийности и затрат на оборудование и реактивы. Кроме того, метод не имеет привязки к оборудованию и экономически выгоден в плане организации и проведения исследования. Минусы метода ИХА: может использоваться только как предварительный метод и требует документирования результатов тестирования.
Плюсы метода ФПИА: высокая специфичность и чувствительность, скорость исследования (15-20 минут), отсутствие пробоподготовки и полуколичественная оценка содержания суммы каннабиноидов. Отрицательными моментами являются: высокая стоимость оборудования и расходных материалов, серийность.
Положительные стороны метода ТСХ: высокая специфичность и селективность, минимальные затраты на оборудование и реактивы. Не дает ложноположительных результатов на барбитураты, никотин, карбомазепин, салициловую кислоту, опиаты, фенацетин, парацетамол, 4-аминофенол, продукты гидролиза анальгина, производные 1,4-бензодиазепина и продукты их гидролиза. Отрицательным моментом является необходимость проведения пробоподготовки.
Таким образом, сравнение методов ФПИА, ИХА и ТСХ показало их высокую специфичность и хорошую чувствительность. Они могут использоваться в качестве предварительных методов исследования для отсеивания отрицательных проб мочи, ограничивая этим круг объектов для дальнейшего инструментального анализа (подтверждающего исследования) только пробами с положительными результатами. Все пробы, давшие положительные результаты ИХА теста, были подтверждены методом ТСХ как положительные на содержание в образцах ТГК-кислоты. Таким образом, ТСХ может использоваться как более чувствительный и селективный метод для подтверждения наличия ТГК-кислоты в моче после предварительного исследования методом ИХА. Методами ИХА и ТСХ можно не только эффективно выявлять потребителей продуктов конопли на этапе предварительного исследовании образцов мочи, но и построить систему анализа на каннабиноиды из сочетания данных методов.
Катаев Сергей Сергеевич
E-mail: forenschemist@narod.ru
