Сокращенный материал, опубликованный в
журнале СМЭ, 2000, №1, с.27-32
Определение в моче 9-карбокси-11-нор-D 9-тетрагидроканнабинола
(Катаев С.С., Смирнова И.Ю.)
Рост злоупотреблений продуктами конопли (гашиш, марихуана), на фоне общего всплеска наркомании, обусловлен в первую очередь низкой стоимостью и доступностью используемого сырья. Это в свою очередь ведет к необходимости проведения химического исследования на наличие в организме человека основных действующих веществ конопли каннабиноидов - D9-тетрагидроканнабинола (ТГК), каннабинола (КНБ), каннабидиола (КНД), а также их метаболитов.
Основные пути метаболизма ТГК ведут к образованию полярных гидроксильных производных, основным из которых является 9-карбокси-11-нор-D9-тетрагидроканнабинол (ТГК-кислота), причем большая часть метаболитов (60-80%) выводится с мочой и калом в форме конъюгатов [1]. Однако, сам ТГК с мочой выводится лишь в следовых количествах [2], в то время как концентрация ТГК-кислоты в моче со временем растет и зависит от дозы ТГК. Так, пик концентрации ТГК-кислоты наблюдается через 7,7± 0,8 (89,8± 31,9 нг/мл) и 13,9± 3,5 (153,4± 49,2 нг/мл) часов после разового курения дозы, приблизительно 15,8 мг и 33,8 мг ТГК, и обнаруживается до 33,7± 9,2 и 88,6± 9,5 часов соответственно [3]. Таким образом, наличие ТГК-кислоты является важным показателем для установления факта употребления продуктов конопли.
Следует отметить, что для уменьшения естественных потерь ТГК-кислоты в образцах мочи, отбираемых для исследования на каннабиноиды, их следует хранить в замороженном виде. Результаты зависимости сохранности ТГК-кислоты в моче от условий хранения, по литературным данным [4], сведены в таблицу 1.
Таблица 1. Сохранение ТГК-кислоты в моче в
зависимости от условий хранения.
Время хранения |
Условия хранения |
Снижение концентрации в % |
10 дней |
при комнатной температуре |
более 22,4 |
4 недели |
в холодильнике |
8,1 |
40 дней |
замороженные |
8,0± 1,6 |
1 год |
замороженные |
15,8± 4,2 |
3 года |
замороженные |
19,6± 6,7 |
Невысокие концентрации аналитических веществ требуют использования в судебно-химическом исследовании селективных и высокочувствительных методов анализа, таких как иммуноферментный анализ и хроматомасс-спекрометрия (ГХ/МС). Далее представлена общая схема исследования с использованием ГХ/МС.
Наличие фенольных и карбоксильной гидроксигрупп в структуре каннабиноидов и ТГК-кислоты требует снижения полярности для улучшения хроматографических характеристик последних. Ниже приведена схема дериватизации, основанная на получении метиловых эфиров названных соединений.
Для КНБ и КНД реакция протекает аналогично ТГК, с той лишь разницей, что КНД образует диметильное производное. Полученные метильные производные устойчивы и сохраняются длительное время (до 1-2 недель).
Оборудование.
Газовый хроматограф НР5890А серии II с масс-селективным детектором НР5972А. Капиллярная кварцевая колонка НР-5MS 25 м Х 0,21 мм Х 0,33 мкм. Скорость потока газа носителя - гелия 1,5 мл/мин, без деления потока. Температура инжектора 250оС. Температура колонки программируемая: 2 минуты при 70оС с дальнейшим повышением до 270оС со скоростью 20оС/мин, общее время анализа 20 минут. Температура интерфейса МСД 280оС. Ионизация электронным ударом с энергией электронов 70 эВ. Режим работы МСД - полное сканирование ионов от 45 до 450 атомных масс.
Методы.
Щелочной гидролиз. К 10 мл мочи прибавляют 0,5 мл 50 % раствора гидроксида натрия, выдерживают при 60оС в течение 20 минут.
К пробе мочи после гидролиза, добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 2 (около 1 мл). Экстракцию проводят дважды по 10 мл смеси гексан-этилацетат (7:1). Органическую фазу отделяют, экстракты объединяют и упаривают досуха.
К сухому остатку прибавляют 100 мкл безводного ацетона, 2-5 мг карбоната калия и 100 мкл метилиодида. Пробу плотно укупоривают и нагревают при 60оС в течение 40 минут. После охлаждения, флакон вскрывают, растворитель упаривают. Сухой остаток двукратно экстрагируют по 2 мл гексана. Гексановые извлечения объединяют, выпаривают досуха. Пробу реконструируют 100 мкл этанола и 1 мкл исследуют методом ГХ/МС.
В таблице 2 приведены основные хроматографические и масс-спектральные данные метильных производных ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты.
Таблица 2. Хроматографические и
масс-спектральные данные для метилированных
ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты.
Соединение |
М.м. |
Характеристические ионы, m/z* |
tуд. абс.,мин |
RI** |
|||||
ТГК-Ме |
328 |
313 |
328 |
285 |
314 |
257 |
329 |
12,07 |
2423 |
КНБ-Ме |
324 |
309 |
310 |
324 |
238 |
252 |
209 |
12,36 |
2490 |
КНД-2Ме |
342 |
287 |
342 |
223 |
213 |
288 |
261 |
12,51 |
2522 |
ТГК-к-та 2Ме |
372 |
313 |
357 |
372 |
314 |
358 |
341 |
13,99 |
2779 |
* Ионы расположены в порядке убывания интенсивности.
** Индексы удерживания определяли по н-алканам.
Реактивы и материалы.
1. Натриевая щелочь, х.ч.
2. Хлороводородная кислота
концентрированная, х.ч.
3. Калия карбонат, х.ч, высушенный
при 170 оС.
4. Гексан, х.ч.
5. Этилацетат, х.ч.
6. Ацетон, х.ч. Очистка [5]: К смеси ацетон и безводный
карбонат калия (20:1 об/вес) осторожно частями
прибавляют не большое количество перманганата
калия и кипятят с обратным холодильником
до исчезновения фиолетовой окраски. Далее растворитель
перегоняют. Т кипения 56,2 оС.
Хранят над б/в К2СО3.
7. Иодметан (метилиодид),
х.ч. Очистка [5]: Растворитель встряхивают с
разбавленным тиосульфатом натрия до обесцвечивания,
затем моют водой, разбавленным карбонатом на-трия и снова
большим количеством воды. Растворитель сушат
безводным гранулированным хлоридом кальция и
перегоняют. Т кипения 42,8оС.
Реагент хранят в холодильнике в посуде
из темного стекла, в контакте с
безводным хлоридом кальция и небольшим
количеством металлической ртути (ртуть лучше заменить
медной стружкой или проволокой).
8. Посуда, используемая в процессах гидролиза и дериватизации силанизированная.
Силанизация стеклянной посуды: посуда
моется хромовой смесью, сушится. Ополаскивается метанолом,
высушивается, затем обрабатывается 1% раствором триметилхлорсилана
в безводном толуоле. Выдерживается в течение 20
минут, ополаскивается метанолом и сушится.
Приложение. На рисунке 1-4 представлены масс-спектры метильных производных ТГК, КНБ, КНД и ТГК-кислоты соответственно. На рисунке 5 приведены фрагменты хроматограммы мочи лица употреблявшего отвар конопли в молоке с экстракцией по 100% ионам в спектрах метильных производных ТГК, КНБ, КНД, ТГК-кислоты. На рисунке 6, 7 приведены фрагменты хроматограммы мочи лица, курившего марихуану.
Примечание: использование щелочного гидролиза приводит к полной потере КНД, однако позволяет более полно извлекать ТГК-кислоту.
Приложение.
Рис.1. Масс-спектр метилового эфира D9-тетрагидроканнабинола.
Рис.2. Масс-спектр метилового эфира каннабинола.
Рис.3. Масс-спектр диметилового эфира каннабидиола.
Рис.4. Масс-спектр диметилового эфира 9-карбокси-11-нор-D9-тетрагидроканнабинола.
Рис.5. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи с экстракцией по наиболее интенсивным ионам метильных производных: КНБ (m/z 309) 12,38 мин, КНД (m/z 287) - отсутствует, ТГК-кислоты (m/z 313) - 14,01 мин.
Рис.6. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по наиболее интенсивным ионам в спектрах метильных производных: КНБ (m/z 309) - отсутствует, КНД (m/z 287) - отсутствует, ТГК-кислоты (m/z 313) - 13,96 мин.
Рис.7. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по характеристическим ионам метилированной ТГК-кислоты (m/z 313, 357, 372).
Литература:
Комментарий: обратите внимание на используемые для дериватизации реактивы: ацетон и метилиодид,
если они приобретены градации х.ч. можно не перегонять, но ацетон обязательно
сушить над безводным карбонатом калия. И ацетон, и карбонат калия следует
обновлять (менять осушитель и сушить, соответственно) не реже раза в месяц. О дериватизации: ацетона можно брать больше 0,2-0,5 мл,
а метилиодида меньше 30-50 мкл, при
этом после охлаждения, ацетоновый раствор можно декантировать в чистую
посуду и реконструировать не этанолом, а этилацетатом (это не так больно
ударяет по колонке). По ХМС анализу:
исследование оптимально вести в режиме селективного ионного мониторинга, т.к.
метода целевая на ТГК кислоту. Но в любом
случае будь то режим селективного ионного мониторинга или полного ионного
сканирования в заданном диапазоне (оптимум 200-400 а.е.) к напряжению настройки МС детектора следует
добавлять 300-400 В. По ходу пробоподготовки стадии
фильтрации отсутствуют, при образовании эмульсии ее разрушают
центрифугированием, отбирать экстракты аккуратно (без водной фракции), флакон
перед помещением в него экстракта следует ополоснуть этанолом. Стеклянная
посуда для анализа как минимум мытая хромовой смесью, оптимально силанизированная.
Катаев Сергей