Опубликована в сборнике: «Актуальные вопросы судебно-химических,
химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа», Материалы
Российской научно-практической конференции с международным участием (28
сентября – 3 октября 2009 года), г. Пермь, с. 70-73.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИДОКАИНА В КРОВИ МЕТОДОМ
ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
Шилова Е.А., Катаев С.С.
ГУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской
экспертизы»
Лидокаина гидрохлорид –
(2’,6’-диметил-2-(диэтиламино) ацетанилида гидрохлорид, моногидрат), синонимы:
ксикаин, ксилодонт, ксилокаин. Представляет собой лекарственное вещество,
применяемое в медицине в качестве местного анестетика, эффективного при всех
видах анестезии (поверхностной, инфильтрационной, проводниковой, перидуральной,
субарахноидальной и др.), а также в качестве противоаритмического средства,
оказывающего мембраностабилизирующее действие (подгруппа IB) на кардиомиоциты проводящей системы сердца и
сократительного миокарда [1].
За последние несколько лет в
России стало не редкостью возбуждение уголовных дел по фактам расследования врачебных
ошибок. Лидокаин же относится к весьма широко применяемым препаратам при
проведении различных медицинских манипуляций для лечебных и диагностических
целей. В этой связи, вопрос о концентрации лидокаина в биообъектах может
становиться принципиальным. В литературе также имеются сведения о смертельных
отравлениях лидокаином при приеме летальных доз [3].
Целью настоящей работы стала разработка методики количественного определения лидокаина
в цельной крови методом газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ/МС).
Оборудование: газовый хроматограф Agilent 6850, масс-селективный детектор Agilent 5973N (Agilent, США), колонка капиллярная НР-5MS, внутренний диаметр
Материалы: все используемые растворители реактивы градации
«х.ч.». Лидокаина гидрохлорид (раствор для инъекций 2% – 2 мл, ПХВП
«Биостимулятор»), тримекаина
гидрохлорид (раствор для инъекций 2% – 2 мл, «Мосхимфармпрепараты»).
Патроны для ТФЭ AccuBond EVIDEX (200 мг/3 мл).
Пробоподготовка: в два флакона вносили по 0,5 мл крови, прибавляли по 25
мкл раствора внутреннего стандарта (спиртовой раствор тримекаина гидрохлорида –
0,04 мг/мл), по 2 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 6,0). Флаконы плотно
укупоривали и помещали в ультразвуковую ванну на 10 минут. Содержимое флаконов центрифугировали
при 3000 об/мин в течение 5 минут, центрифугат отделяли от осадка.
Процедура
твердофазной экстракции (ТФЭ): кондиционирование сорбента проводили путем последовательного
пропускания через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН
6,0). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин.
Промывку
осуществляли последовательно: 1 мл 1/15 М буфера фосфатного (рН 6,0), 1 мл 0,1
М кислоты уксусной и 1 мл 10% этанола. Сушку патрона проводили под вакуумом в
течение 5 минут. Очистку осуществляли двухкратным пропусканием через сорбент 1
мл смеси н-гексан–этилацетат (3:1). Элюировали дважды по 1 мл смеси
дихлорметан–изо-пропанол–25% аммиак (4:1:0,1), элюаты испаряли в токе азота при
60оС.
Исследование
образцов: сухие остатки растворяли в 200 мкл этилацетата и последовательно
вводили в испаритель хромато-масс-спектрометра. Условия ГХ/МС исследования: колонка
30 м х 0,25 мм. Скорость газа носителя (гелий) – 1,5 мл/мин. Температура
инжектора и интерфейса 250о и 280оС, температура колонки
– градиент 120оС (1 мин.) – 225оС, скорость
программирования 35о минуту, далее до 285оС со скоростью
программирования 15оС/мин. Ввод пробы без деления потока
газа-носителя. Режим работы детектора: селективный ионный мониторинг (SIM).
Таблица
Газохроматографические и
масс-спектральные характеристики лидокаина и тримекаина
|
Соединение |
m/z и интенсивности трех
основных ионов (%) |
Время удерживания, мин |
Интервал регистрации
ионов, мин |
||
|
Лидокаин |
86 |
58(7,30) |
234(2,30) |
5.19 |
5.00 – 5.45 |
|
Тримекаин* |
86 |
134(5,80) |
248(4,00) |
5.61 |
5.45 – 7.00 |
*Внутренний
стандарт
Калибровочный график строили
методом внутреннего стандарта.
В
пробы крови объемом по 0,5 мл добавляли лидокаина гидрохлорид моногидрат в
пересчете на основание по 1000 нг/мл, 2000 нг/мл, 10000 нг/мл, 20000 нг/мл и
25000 нг/мл и внутренний стандарт – раствор тримекаина гидрохлорида в
количестве 1000 нг. Проводили по два
определения для каждой калибровочной точки с использованием методики пробоподготовки аналогичной выше изложенной. Количественное определение проводили
с использованием ПЭВМ и программного обеспечения G1701DA MSD ChemStation.
Расчет концентрации лидокаина проводили
по формуле (рис.1), где Сx –
концентрация лидокаина в объекте, мг/л; Q – количество лидокаина, полученное по графику, нг; а
– объем крови, взятый на исследование, мл.
Полученный для крови градуировочный график является
линейными в диапазоне концентраций 1,0 – 25 мг/л. Коэффициент корреляции
графика по крови составил r2=0,992.
Рис. 1 Расчетная формула
Для
извлечения лидокаина из крови методика предусматривает ТФЭ с применением
патронов с привитой смешанной фазой. Основной механизм взаимодействия лидокаина
– ионное взаимодействие третичного алифатического атома азота в протонированной
форме с анионным центром сорбента (привитые сульфогруппы).
Выбор
тримекаина в качестве внутреннего стандарта обусловлен его структурным сходством
с лидокаином, а также подобными физико-химическими (pKa, LogP), газохроматографическими (близкие
времена удерживания) и масс-спектральными (одинаковый базовый ион) характеристиками,
что в большой степени обеспечивает стабильность калибровки.
Предел
обнаружения (LOD) лидокаина составил 100 нг/мл; предел
количественного определения (LOQ) – 1000 нг/мл.
Данная
методика была применена для количественного определения лидокаина в крови от
трупа гр. Г., умершего в больнице после бронхоскопии, при проведении которой
данный препарат был использован для терминальной анестезии. Содержание
лидокаина в крови составило 1,39 мг/л, что укладывается в диапазон
терапевтических концентраций [2].
Таким
образом, разработанная методика позволяет провести количественное определение
лидокаина в крови, используя небольшие объемы биологического объекта, с
применением современных физико-химических методов.
Список
литературы
1.
Харкевич Д.А.
Фармакология / Д.А. Харкевич – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 295-297.
2.
Baselt, R.C. Disposition of Toxic Drug and Chemicals
in Man / R.C. Baselt, R.H. Cravey – 4-d Ed. – California: Chemical Toxicology
Institute Forest City. – 1995.
3. Kalin I.R. A case
of homicide by lethal injection with lidocaine / I.R. Kalin // Journal of
Forensic sciences. – Vol. 47. – Issue 5. – P. 343-345.
