Актуальные проблемы патологической анатомии и судебной медицины.
Межвузовский сборник научных работ.
Изд. Саратовского медицинского университета, 2001, с. 158-161.
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ В ТРУПНОЙ КРОВИ.
С.С. Катаев, В.С. Чухустова, П.А. Акимов, Л.А. Опутина
(Пермское областное бюро судебно-медицинской экспертизы - нач. Перминов В.И.)
Традиционный спектрофотометрический метод определения нитритов в трупном материале, основанный на получении азокрасителей, является специфичным и чувствительным. Однако при работе с трупной кровью, когда используется для осаждения белков 4,5 % раствор сульфата цинка, очень редко удается получить прозрачный и неокрашенный раствор. Учитывая вышеизложенное, нами разработана методика определения нитритов в крови с использованием неводного растворителя - ацетонитрила. Это позволяет получать слабоокрашенные растворы и повысить стабильность окраски азокрасителя даже при высоких концентрациях последнего, в то время как в водных растворах происходит выпадение осадка.
Кроме того, параллельно химическому исследованию проводили определение процентного содержания метгемоглобина, так как его повышенная концентрация является косвенным фактором в установлении отравления нитритами. Как известно, содержание метгемоглобина зависит от состояния редуцирующих систем крови (ферментной системы метгемоглобинредуктазы и антиоксидантной системы, главным образом системы глютадиона и супероксиддисмутазы). Также известно, что при добавлении к крови нитрита натрия (даже в избытке) кроме метгемоглобина, содержание которого может достигать 60-70% [1], всегда образуются комплексные соединения: нитрозогемоглобин и метгемоглобин нитрит, УФ-спектр которых сходен со спектром оксигемоглобина. Таким образом, процентное содержание метгемоглобина при отравлениях нитритами может быть не высоким.
Оборудование и методы.
Спектрофотометр "СФ-46", термоблок "ПЭ-4030" ("Экрос", С.-Петербург), центрифуга MPW-310 (Польша).
Рабочие растворы нитрита натрия готовили в концентрациях 1,0 и 10 мг/мл. Калибровочные растворы готовили из рабочего раствора 1,0 мг/мл путем последовательных разведений в концентрациях: 0,2; 1,0; 4,0; 6,0; 10 мкг/мл.
К 2 мл калибровочного раствора прибавляли 8 мл ацетонитрила, перемешивали. К 4 мл раствора добавляли 250 мкл 1 % раствора сульфаниловой кислоты (САК) в 1,0 н. растворе хлористоводородной кислоты, выдерживали 5 минут при комнатной температуре и затем вносили 250 мкл 0,2 % раствора a-нафтиламина (a-НА) в 0,1 н. растворе хлористоводородной кислоты. Далее пробу герметично закрывали и нагревали при 60оС в течение 10 минут. Охлаждали 15 минут и определяли оптическую плотность при l =517 нм, относительно раствора сравнения. Раствор сравнения готовили аналогично из оставшейся части смеси ацетонитрила с калибровочным раствором 4 мл, добавляя вместо реактивов (САК и a-НА) 500 мкл 0,5 н. раствора хлористоводородной кислоты. Для каждой концентрации проводили по три определения. График зависимости концентрации нитрита от оптической плотности в диапазоне концентраций 0,2-10,0 мкг/мл является линейным.
Для исследования использовали трупную кровь, отобранную у скоропостижно скончавшихся людей с постмортальным периодом не превышающим 24 часов. К пробам крови объемом 20 мл прибавляли соответствующее количество водного раствора нитрита натрия 10 мг/мл, для получения расчетной концентрации последнего в образце: 25, 50, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл. Образцы инкубировали в течение суток при +4оС.
К 2 мл образца крови прибавляли 8 мл ацетонитрила, тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Полученную жидкость декантировали в центрифужную пробирку, пробирку укупоривали и центрифугировали 10 мин при 6000 об/мин. Центрифугат сливали в мерную пробирку, доводили объем до 10 мл дистиллированной водой, перемешивали. К 4 мл полученного раствора добавляли 250 мкл 1 % раствора САК в 1,0 н. растворе хлористоводородной кислоты, выдерживали 5 минут при комнатной температуре и затем вносили 250 мкл 0,2 % раствора a -НА в 0,1 н. растворе хлористоводородной кислоты. Далее пробу герметично закрывали и нагревали при 60оС в течение 10 минут. Охлаждали 15 минут и при наличии розового окрашивания определяли оптическую плотность при l =517 нм, относительно раствора сравнения. Раствор сравнения готовили аналогично из оставшейся части смеси ацетонитрила с образцом 4 мл, добавляя вместо реактивов (САК и a-НА) 500 мкл 0,5 н. раствора хлористоводородной кислоты. При значительных концентрациях нитрита, проводили разведение полученных раствора азокрасителя и раствора сравнения смесью ацетонитрил - 0,5 н. раствор хлористоводородной кислоты (4:0,5). Для каждого образца крови концентрации проводили по три определения. Среднее отклонение в сериях 15,6%.
Определение метгемоглобина проводили спектрофотометрическим методом по Кушаковскому [1], совместно с определением концентрации сульфгемоглобина в одной пробе крови.
Обсуждение результатов.
В результате исследования было установлено, что биохимические системы крови в значительной степени связывают нитриты. Так, при добавлении нитрита натрия к крови в диапазоне концентраций от 25 до 250 мкг/мл, как правило, в результате химического исследования нитриты не определяются, либо определяются в незначительных количествах от 0,08 до 3,6 % от общего введенного нитрита. При концентрациях 500 и 1000 мкг/мл найдено от 1,1 до 30,3 %. В то время как концентрация метгемоглобина постепенно возрастает в диапазоне от 25 до 250 мкг/мл, но лишь при введенных концентрациях нитрита натрия 500 и 1000 мкг/мл достигает существенных значений. Общие данные полученные химическим и биохимическим исследованиями приведены в таблице.
Сводная таблица результатов химического и биохимичского
исследований.
|
Введенная концентрация, мкг/мл |
Диапазон определен. MetHb, % |
MetHbср, % |
Диапазон найденных конц., мкг/мл |
Конц.ср, мкг/мл |
Кол-во серий |
|
0 |
0,1 - 1,7 |
0,85± 0,5 |
0 |
0 |
9 |
|
25 |
0,36 - 3,6 |
1,75± 1,7 |
0 - 0,32 |
0,11± 0,19 |
3 |
|
50 |
0,61 - 5,4 |
2,5± 1,6 |
0 - 1,6 |
0,51± 0,63 |
8 |
|
100 |
2,1 - 12,3 |
6,1± 3,1 |
0 - 3,62 |
0,79± 1,3 |
8 |
|
250 |
11,5 - 48,5 |
22,9± 12,0 |
0,2 - 4,85 |
2,2± 1,6 |
8 |
|
500 |
35,3 - 73,0 |
58,2± 13,9 |
5,7 - 94,5 |
31,8± 26,9 |
9 |
|
1000 |
53,0 - 66,8 |
59,7± 5,1 |
50,8 - 303,0 |
178± 92 |
6 |
Таким образом, при отравлениях нитритами процентное содержание метгемоглобина может быть незначительным и находиться в диапазоне от 11,5 до 48,5%, в то время как концентрация нитрита в крови, при которой наблюдался смертельный исход, в ряде случаев находилась на уровне 0,5-0,6 мкг/мл [2].
Данный факт подтверждается и двумя независимыми экспертными случаями смертельных отравлений нитритами, имевшихся в нашей практике. Так при биохимическом исследовании в образцах трупной крови было определено содержание метгемоглобина 35,0 и 8,4%, когда химическое исследование с применением изложенной методики показало наличие нитритов в концентрациях 198,1 и 1,9 мкг/мл (в пересчете на нитрит натрия), соответственно. После сохранения первого образца в замороженном виде (при -20оС) 8 месяцев, было проведено повторное определение процентного содержания метгемоглобина и концентрации нитритов, которые составили 37,5% и 91,3 мкг/мл, соответственно.
Результаты нашей работы продемонстрировали целесообразность проведения химического определения нитритов в крови спектрофотометрическим методом по азокрасителям, являющимся наиболее специфичным и чувствительным, наряду с биохимическим исследованием крови на наличие метгемоглобина в случаях отравления нитритами.
Чувствительность предлагаемого метода 0,1 мкг/мл, при этом наличие нитритов может быть оценено как качественно, визуально по наличию характерного розового окрашивания при концентрациях от 0,1-0,2 мкг/мл, так и количественно.
Выводы.
Разработан простой и чувствительный метод качественного и количественного определения нитритов в трупной крови. Отмечено, что наряду с определением метгемоглобина, в случаях отравления нитритами крайне важно проводить прямое определение нитритов в крови химическими методами.
Литература.
forenschemist@narod.ru
